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如何選購適合自己的熒光定量PCR儀

更新時間:2019-09-29      點擊次數(shù):2028

二手熒光定量PCR儀因操作方便、運行速度快、實驗結(jié)果準(zhǔn)確,受到越來越多的分子生物學(xué)研究者青睞。在實驗技術(shù)成熟的今天,也許對你來說,其難點不是實驗技術(shù)上的問題——而是 如何選購適合自己的熒光定量PCR儀 ——你要征詢實驗室成員的意見、分析實驗室目前乃至將來的需求、平衡實驗室的預(yù)算,更要詳細(xì)研究各種極富誘huo力的宣傳資料。面對各種不同性能的產(chǎn)品,您又該如何選擇呢?

 

首先建議大家走出認(rèn)識二手熒光定量PCR儀的兩個誤區(qū):

 

誤區(qū)一:儀器通道越多越好

 

隨著PCR技術(shù)的成熟運用,多重擴增越來越熱鬧,二手熒光定量PCR儀儀也不能幸免。從初期ABI公司推出的單通道二手熒光定量PCR儀儀發(fā)展到如今各個廠家都推出4通道、5通道甚至6通道二手熒光定量PCR儀儀,眼花繚亂的選擇讓人無所適從,就有人一不小心走進(jìn)了“通道越多越好”的誤區(qū)。

 

在使用有些廠家5通道的熒光定量儀時,為了確保實驗結(jié)果的性和準(zhǔn)確性都要在實驗中使用ROX(一種熒光染料)或的Referencedye,這些熒光染料都應(yīng)單獨使用一個檢測通道。這樣以來,能檢測多重PCR熒光信號的有效通道只有4個,而且使用校正染料可能會增加后期的使用成本。有的二手熒光定量PCR儀的檢測通道是只為自已廠家的的熒光染料或試劑開放的,有效檢測通道也絕非像宣傳資料中宣稱的那么多。在購買前確認(rèn)二手熒光定量PCR儀儀器的有效檢測通道尤為重要,不能單單只聽宣傳。

 

考慮多重二手熒光定量PCR儀的通道數(shù)的時候也應(yīng)該從實驗室實際情況出發(fā),多重PCR并非人人適用、人人可用,因為它使實驗復(fù)雜化了,況且大多數(shù)實驗室熒光定量實驗常年只使用SYBRGreen一種染料,實在沒有必要選購更多通道。

 

誤區(qū)二:real-timePCR儀無需梯度功能

 

對于使用染料法的定量PCR反應(yīng),雖然有各種各樣的PCR引物設(shè)計軟件或者經(jīng)驗公式計算熔解溫度(Tm值),但運用的公式不同、引物序列不同,Tm值的差異會很大。引物的熔解溫度決定了退火溫度。而且模版中堿基的組合千變?nèi)f化,對于特殊片斷,經(jīng)驗公式得到的數(shù)據(jù)不一定能得出準(zhǔn)確的結(jié)果,退火溫度細(xì)微的差異對結(jié)果都可能產(chǎn)生決定性的影響,因而“摸條件”一度是讓人很頭疼的問題。梯度PCR的出現(xiàn)部分解決了一些問題——在反應(yīng)過程中每個孔的溫度控制條件可以在范圍內(nèi)按照梯度變化,根據(jù)結(jié)果,一步就可以摸索出適合的反應(yīng)條件。

 

不單退火溫度,連變性溫度和延伸溫度都可以優(yōu)化——對于多種聚合酶混合酶擴增的多數(shù)高保真Taq酶來說這個非常重要,因為Taq和校正酶的反應(yīng)溫度可能有顯著差異,優(yōu)化延伸溫度就顯得很重要。

 

使用有梯度功能的二手熒光定量PCR儀可以一次完成以往多次實驗才能完成的優(yōu)化過程,簡化了摸索PCR反應(yīng)條件的繁瑣實驗,既節(jié)省實驗時間提率,又節(jié)省實驗成本。

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